蛋白定量

　　1、蛋白濃度測定

　　蛋白定量的方法有很多種，應(yīng)用較多的主要有兩種：BCA蛋白定量檢測法和Bradford蛋白定量檢測法，市售的蛋白定量試劑盒也多基于上述兩種檢測方法而開發(fā)的。兩種方法均需配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，蛋白與定量試劑經(jīng)過一定時(shí)間的反應(yīng)（BCA法反應(yīng)為37℃、20-30min，Bradford法反應(yīng)一般為37℃，5min），酶標(biāo)儀讀取樣品的OD值，繪制的蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算WB蛋白的濃度。兩種檢測方法筆者均有使用經(jīng)驗(yàn)，相比BCA法，Bradford法不僅節(jié)省反應(yīng)時(shí)間，也無需配置反應(yīng)試劑，簡單、快速、好用，筆者推薦Bradford法測定蛋白濃度。

　　嚴(yán)格來說，每次的蛋白濃度測定均需配制新鮮蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，保證每次測到的蛋白濃度的準(zhǔn)確性。然而，WB法評(píng)估蛋白表達(dá)水平本身就是一種半定量或者相對(duì)定量，因此在實(shí)際蛋白樣本準(zhǔn)本及濃度測定時(shí)只需保證均一性即可，即使用同樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算同一批蛋白的濃度，如果計(jì)算準(zhǔn)備即可保證蛋白上樣時(shí)內(nèi)參水平基本一致。因此，在實(shí)際操作中我們只需測定一次標(biāo)準(zhǔn)品的OD值、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可用此曲線來計(jì)算后續(xù)實(shí)驗(yàn)蛋白的濃度，節(jié)省時(shí)間和試劑。

　　2、蛋白濃度的調(diào)平

　　有研究者喜歡計(jì)算添加loading buffer及變性以后的蛋白終濃度和上樣體積，然后在蛋白上樣時(shí)用loading buffer配平，保證上樣體積基本一致。而筆者更喜歡用loading buffer和蛋白裂解液調(diào)整蛋白濃度到基本一致（一般為1-2ug/ul）以后再變性，如此蛋白上樣時(shí)只需使用相同體積的蛋白樣品即可，筆者經(jīng)驗(yàn)是這樣的方法相對(duì)省時(shí)且不容易出錯(cuò)。

　　蛋白提取

　　1、蛋白裂解液與裂解環(huán)境

　　現(xiàn)如今，商業(yè)化的蛋白裂解有很多中，有強(qiáng)效的、裂解時(shí)間短（約5-10min）；也有普通的、裂解時(shí)間尚可（約30min）；也有強(qiáng)效的，裂解時(shí)間極短（小于5min）。其中，上述裂解液的裂解環(huán)境，一般推薦為冰上或者4℃裂解，減少蛋白降解；而在蛋白裂解液中也推薦加用磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑，抑制細(xì)胞內(nèi)酶對(duì)蛋白的自然降解。

　　對(duì)于普通蛋白的提取，如實(shí)驗(yàn)時(shí)間無特殊，選用普通的蛋白裂解液、冰上裂解即可；對(duì)于極易受環(huán)境影響的蛋白（比如低氧相關(guān)蛋白，HIF-1等），研究報(bào)道將細(xì)胞從低氧培養(yǎng)箱中取出2-3min即可影響HIF-1表達(dá)，因此宜選用強(qiáng)效蛋白裂解液，并在低氧培養(yǎng)箱（37℃）中快速裂解。

　　2、組織蛋白提取

　　在組織蛋白提取過程中，一般推薦加用蛋白裂解液（磷酸酶和蛋白酶抑制劑）后，冰上研磨、勻漿化處理組織。組織來源不同，蛋白的產(chǎn)出亦不相同。歡迎各位留言，分享經(jīng)驗(yàn)，比如1mg組織能產(chǎn)出多少蛋白。