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天天都在用標(biāo)記抗體，但對抗體的標(biāo)記方法，你了解多少呢？

更新時間：2022-05-20  |  點擊率：2145



關(guān)注Bioss公眾號的小伙伴都知道，Bioss在4月份與大家分享了直標(biāo)一抗在科學(xué)研究領(lǐng)域應(yīng)用的優(yōu)勢及要點，那么問題來了，直標(biāo)一抗都有哪些標(biāo)記物呢？其常用的標(biāo)記方法你了解嗎？

如此重要的問題，且聽Bioss小編慢慢道來......

抗體標(biāo)記是指將標(biāo)記物（酶、熒光染料、生物素、膠體金等）以共價結(jié)合或物理吸附的方式與抗體進(jìn)行連接，形成抗體-標(biāo)記物復(fù)合物；在抗體-標(biāo)記物復(fù)合物與待檢物形成特異性多元復(fù)合物后，通過熒光顯微鏡、射線測量儀、酶標(biāo)檢測儀、電子顯微鏡和發(fā)光免疫測定儀等精密儀器對試驗結(jié)果進(jìn)行檢測，進(jìn)而實現(xiàn)細(xì)胞、亞細(xì)胞、超微結(jié)構(gòu)等不同水平上對抗原、抗體反應(yīng)的定性及定位研究，或者應(yīng)用各種免疫分析方法對體液中的半抗原、抗原進(jìn)行定性和定量測定。目前抗體標(biāo)記技術(shù)己被廣泛用于醫(yī)學(xué)病理學(xué)、免疫組織化學(xué)、分子生物學(xué)、生物制藥等領(lǐng)域的分析研究與技術(shù)測定。下面簡要介紹幾種常見的抗體標(biāo)記方法：


一、酶標(biāo)記

以共價鍵結(jié)合的方式將酶聯(lián)結(jié)在抗體上，得到酶標(biāo)抗體復(fù)合物，之后借助酶對底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，這些有色產(chǎn)物可用肉眼、顯微鏡、分光光度計等進(jìn)行觀察或測定，從而證明發(fā)生了相應(yīng)的免疫反應(yīng)。在生命科學(xué)的科學(xué)研究過程中，常用的抗體標(biāo)記酶包含辣根過氧化物酶 (HRP)和堿性磷酸酶 (AP)。
1、辣根過氧化物酶標(biāo)記
辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體一般采用過碘酸鈉法。過碘酸鈉法的原理是通過過碘酸鈉將HRP的糖基氧化成醛基，該醛基可與抗體IgG上的氨基進(jìn)行結(jié)合，形成Schiff氏堿。
2、堿性磷酸酶標(biāo)記
堿性磷酸酶標(biāo)記抗體時常用的是戊二醛一步法。在標(biāo)記時，先將堿性磷酸酶與單抗混合，之后加入適量的戊二醛，使堿性磷酸酶和抗體蛋白的氨基分別與兩個醛基結(jié)合，進(jìn)而形成結(jié)合物。




二、熒光染料標(biāo)記

熒光標(biāo)記技術(shù)是指將能發(fā)射熒光的標(biāo)記物通過共價結(jié)合或物理吸附等方式標(biāo)記于目標(biāo)分子的某個基團(tuán)上，從而利用標(biāo)記物的熒光特性來反映研究對象的信息。常見的熒光染料包含小分子熒光染料、時間分辨熒光材料、上轉(zhuǎn)化發(fā)光材料、量子點熒光材料等。

1、小分子熒光染料
目前，關(guān)于小分子熒光染料的報道中，常用到的熒光基團(tuán)多為芳香族的化合物，在抗體標(biāo)記過程中常用到的小分子染料包含以下幾類：
(1)熒光素類 (如FITC)：異硫氰酸熒光素 (FITC)是目前應(yīng)用較為廣泛的一種熒光素衍生物，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。FITC標(biāo)記抗體是基于FITC 的異硫氰基在堿性條件下能與IgG的自由氨基結(jié)合，進(jìn)而形成IgG與熒光素的結(jié)合物。
(2)羅丹明類：是以氧雜蒽為母體的堿性呫噸染料，是生物醫(yī)學(xué)中常用的一類熒光染料，一般通過與被標(biāo)記物的氨基結(jié)合實現(xiàn)標(biāo)記。
(3)花菁類熒光染料 (如Cy系列染料)：菁染料在光照下不穩(wěn)定，但具有摩爾消光系數(shù)高、光譜范圍廣且光量子點產(chǎn)率高等特性，在使用時可通過染料的NHS與抗體的氨基連接，進(jìn)而形成結(jié)合復(fù)合物。
(4)羅丹明或coumarin等染料的衍生物 (如Alexa Fluor)：Alexa Fluor通過利用磺酸或磺酸鹽代替羅丹明或coumarin等染料中的氫原子而合成，主要通過磺酸酯活性基團(tuán)與生物分子中的伯胺相結(jié)合形成琥珀酰亞胺酯穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，從而實現(xiàn)對蛋白質(zhì)、核酸等生物分子的 Alexa Fluor 熒光標(biāo)記。
(5)其他染料，如吖啶、菲啶類、查爾酮和coumarin類、稠環(huán)芳烴類、噻嗪/噁嗪類、丹磺酞胺、卟啉類等。

部分常見熒光標(biāo)記物的激發(fā)和發(fā)射波長

2、時間分辨熒光材料、上轉(zhuǎn)化發(fā)光材料、量子點熒光材料
相對于小分子熒光染料，時間分辨熒光材料、上轉(zhuǎn)化發(fā)光材料、量子點熒光材料是三種新型的熒光材料，其中，時間分辨熒光材料以鑭系元素, 如銪 (Eu)、鋱 (Tb)、釤 (Sm)等標(biāo)記抗體, 利用時間分辨熒光儀特定的延遲一段時間測量，獲得鑭系元素的特異熒光信號；上轉(zhuǎn)化發(fā)光材料是在受到低能量的光激發(fā)情況下，發(fā)射出高能量的光，即經(jīng)波長長、頻率低的光激發(fā)，材料發(fā)射出波長短、頻率高的光；量子點 (quantum dots)是一類由Ⅱ－Ⅵ族或Ⅲ－Ⅴ族元素組成的能夠接受激發(fā)光產(chǎn)生熒光的半導(dǎo)體納米顆粒，量子點熒光強(qiáng)度高且持續(xù)時間長，光化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，不易發(fā)生光漂白，可經(jīng)受反復(fù)多次的激發(fā)，這為研究生物細(xì)胞內(nèi)分子之間的長時間作用提供了有力的工具。
在標(biāo)記方法上，這三種熒光材料一般會利用表面羧基基團(tuán)與抗體的氨基基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)。



三、生物素標(biāo)記

生物素標(biāo)記反應(yīng)常用生物素琥珀酰亞胺酯進(jìn)行。生物素是與抗體分子的游離賴氨酸等發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)而完成標(biāo)記。一般一個抗體可以標(biāo)記3-5個生物素，標(biāo)記時，生物素與抗體的比率受抗體濃度影響，對于10 mg/ml 的抗體溶液來說，生物素應(yīng)超過蛋白12倍（摩爾數(shù)），對于2 mg/ml 的抗體溶液應(yīng)超過20倍，生物素也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。




四、膠體金標(biāo)記

膠體金標(biāo)記是利用氯金酸在還原劑作用下聚合成直徑 1~150nm的金顆粒, 形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。由于靜電作用成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài), 稱膠體金。

膠體金標(biāo)記就是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機(jī)理是膠體金顆粒具有高電子高密度的特性, 其表面的負(fù)電荷能與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)靜電吸附而牢固結(jié)合。

不同免疫檢測實驗中經(jīng)常用到的標(biāo)記物類型匯總